近期，來(lái)自瑞士Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research研究所的P. Liberali組與Viventis公司工程師合作，使用長(zhǎng)時(shí)間高分辨類(lèi)器官光片顯微鏡-LS2在bioRxiv上在線發(fā)表了題為Open top multi sample dual view light sheet microscope for live imaging of large multicellular systems的文章。這篇文章對(duì)該技術(shù)的核心細(xì)節(jié)進(jìn)行詳盡展示。
長(zhǎng)時(shí)間高分辨類(lèi)器官光片顯微鏡-LS2是由瑞士Viventis公司推出的一款全新光片成像平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間、高分辨、高通量、多樣品同時(shí)成像，非常適合對(duì)直徑達(dá)300 μm的光敏樣品（如卵母細(xì)胞，胚胎和類(lèi)器官）進(jìn)行長(zhǎng)期實(shí)時(shí)高時(shí)空分辨率和低光毒性的觀察與成像。該技術(shù)一經(jīng)推出便已發(fā)布多篇Science/ Nature主刊 [1-5]。
長(zhǎng)時(shí)間高分辨類(lèi)器官光片顯微鏡-LS2腸道類(lèi)器官成像效果
摘要：
多細(xì)胞系統(tǒng)會(huì)在數(shù)周內(nèi)從單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)成為類(lèi)器官、由數(shù)千個(gè)細(xì)胞組成完整組織，此類(lèi)樣品的實(shí)時(shí)成像一直具有挑戰(zhàn)性。為了跨越這些長(zhǎng)時(shí)間、空間尺度的難題，本文作者提出了一種開(kāi)放式頂部雙側(cè)成像和雙側(cè)照明的光片顯微鏡，專(zhuān)門(mén)用于單細(xì)胞分辨率的發(fā)育過(guò)程中的大型樣本的實(shí)時(shí)成像。作者使用新開(kāi)發(fā)的光片顯微鏡對(duì)多種樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)成像研究，結(jié)果突出顯示了其在大型標(biāo)本(如成熟的腸道類(lèi)器官等)中獲得定量單細(xì)胞信息的能力。
研究背景：
單個(gè)細(xì)胞發(fā)育成為復(fù)雜組織的動(dòng)力學(xué)、可視化以及潛在分子機(jī)制的理解是細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)的首要目標(biāo)。然而，這些復(fù)雜的生物現(xiàn)象往往跨越大的空間和時(shí)間生物學(xué)尺度，特別是類(lèi)器官等體外模型系統(tǒng)，經(jīng)常受到樣品間異質(zhì)性的影響。設(shè)計(jì)用于此類(lèi)系統(tǒng)實(shí)時(shí)成像的顯微鏡需要在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中提供高樣品通量才能得出結(jié)論，且需要為光散射較大的樣品提供足夠的空間和時(shí)間分辨率和高圖像質(zhì)量，同時(shí)最大限度地減少光劑量并保持樣品上樣方便。目前，大多數(shù)的光片顯微鏡技術(shù)由于其低光毒性成為了克服上述一些挑戰(zhàn)的技術(shù)方案之一。但這些技術(shù)僅限于每次實(shí)驗(yàn)僅對(duì)一個(gè)或極少數(shù)樣品進(jìn)行成像，且這些系統(tǒng)缺乏從對(duì)側(cè)進(jìn)行多視成像的可能性，不適合發(fā)育較大的樣本。
文章亮點(diǎn)：
本文展示了一種開(kāi)放式、雙側(cè)成像和雙照明的長(zhǎng)時(shí)間高分辨類(lèi)器官光片顯微鏡-LS2。其結(jié)合了多視圖光片顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)，具有開(kāi)放式幾何形狀和多孔樣品支架，可以對(duì)大型多細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行長(zhǎng)期多位置3D實(shí)時(shí)成像。作者通過(guò)對(duì)小鼠腸道、肝臟和唾液腺類(lèi)器官、類(lèi)原腸胚、水螅和人結(jié)腸癌類(lèi)器官的長(zhǎng)期實(shí)時(shí)成像，展示了該系統(tǒng)在各種模型系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高圖像質(zhì)量的能力，其尺寸可達(dá)550 μm，記錄時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12天。此外，本文獲得了跨生物尺度的定量特征，并通過(guò)對(duì)腸道類(lèi)器官和類(lèi)原腸胚的跟蹤和分割提供了詳細(xì)的單細(xì)胞分析，這是新開(kāi)發(fā)的Viventis長(zhǎng)時(shí)間高分辨類(lèi)器官光片顯微鏡-LS2才能實(shí)現(xiàn)的。
詳細(xì)數(shù)據(jù)：
本文展示的光片顯微鏡包含兩顆相對(duì)的照明物鏡(尼康10X, NA 0.2)，每顆從水平面略微向上傾斜，從兩個(gè)側(cè)面照亮樣品，兩顆相對(duì)的成像物鏡從兩個(gè)方向成像(尼康16X, NA 0.8， 該系統(tǒng)也兼容尼康25X, NA 1.1)(圖1)。這種幾何形狀在兩個(gè)照明物鏡上方創(chuàng)造了一個(gè)無(wú)阻的線性空間用于定制設(shè)計(jì)的多孔樣本池(圖1-2)，該樣本池包含多達(dá)四個(gè)可互換的樣品室陣列， 用于多位置成像。浸入介質(zhì)被放置在一個(gè)儲(chǔ)層中，填充兩個(gè)水浸入檢測(cè)物鏡之間的空間。 為了獲得兩個(gè)相對(duì)的光片以盡可能大的角度照亮樣品,作者使用了超長(zhǎng)工作距離的空氣物鏡， 通過(guò)玻璃窗將照明光耦合到浸入介質(zhì)中，并設(shè)計(jì)了一個(gè)定制的校正三重透鏡來(lái)補(bǔ)償球面和色差。物鏡區(qū)域是具溫度控制的，樣品被封閉在一個(gè)控制CO2濃度的隔間中。額外的光束路徑是使用其中一個(gè)檢測(cè)物鏡作為聚光鏡來(lái)照亮樣品并獲取透射光圖像。為了以最佳方式安裝不同的生物樣品，作者在熱成型過(guò)程中開(kāi)發(fā)了由氟乙烯丙烯(FEP)箔制成的可定制腔室。該腔室適合于兩顆檢測(cè)物鏡之間的6毫米空間區(qū)域，并允許從頂部加液、移液，滿足不同生物樣品的活細(xì)胞培養(yǎng)要求。
圖1 長(zhǎng)時(shí)間高分辨類(lèi)器官光片顯微鏡-LS2光路圖
圖2 長(zhǎng)時(shí)間高分辨類(lèi)器官光片顯微鏡-LS2物鏡及樣本池視圖
在作者之前的工作中，使用了本文所介紹的顯微鏡的前身，上一代技術(shù)的顯微鏡只構(gòu)建了一個(gè)檢測(cè)物鏡來(lái)跟蹤發(fā)育中的腸道類(lèi)器官中的細(xì)胞。 然而，所提供的成像深度不足以跟蹤較大標(biāo)本中的細(xì)胞，包括成熟的類(lèi)器官。新設(shè)計(jì)的雙成像物鏡、雙側(cè)照明方法克服了這一障礙。 作者使用細(xì)胞周期報(bào)告基因FUCCI2，在3天的時(shí)間過(guò)程中對(duì)成熟小鼠腸道類(lèi)器官的隱窩和絨毛形成進(jìn)行成像(圖2和視頻2)。 在隱窩和絨毛形成的背景下監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期狀態(tài)。 使用多位置成像，同時(shí)獲得了多個(gè)類(lèi)器官的數(shù)據(jù)集。單細(xì)胞分辨率的雙色成像深度為360µm， 時(shí)間分辨率為10分鐘(視頻1)，以非常細(xì)致的細(xì)節(jié)顯示發(fā)育中的小鼠腸道類(lèi)器官的整體動(dòng)力學(xué)。整個(gè)單細(xì)胞的可視化樣本量要求通過(guò)雙側(cè)成像實(shí)現(xiàn)高圖像質(zhì)量。我們通過(guò)將單個(gè)檢測(cè)物鏡的XZ部分與融合數(shù)據(jù)進(jìn)行比較來(lái)說(shuō)明這一點(diǎn)(圖2)。 隨著成像深度的增加， 單個(gè)視圖的切片顯示出預(yù)期的退化，而融合的數(shù)據(jù)由兩個(gè)視圖的最佳質(zhì)量組合組成，并且能夠在整個(gè)體積中繪制單個(gè)細(xì)胞(視頻2)。這種策略對(duì)于整個(gè)樣本的3D成像是十分必要的。
為了進(jìn)一步評(píng)估使用兩個(gè)相對(duì)的成像物鏡對(duì)圖像質(zhì)量的改善，作者通過(guò)計(jì)算兩個(gè)物鏡的每個(gè)z截面的離散余弦變換DCT來(lái)比較圖像質(zhì)量隨成像深度的增加。例如，對(duì)腸道和人類(lèi)結(jié)腸癌類(lèi)器官進(jìn)行了比較(圖3)。兩種模型系統(tǒng)都顯示，隨著成像深度和距離檢測(cè)物鏡的距離增加，圖像質(zhì)量明顯下降，這可以通過(guò)組合來(lái)自兩個(gè)相反物鏡的數(shù)據(jù)來(lái)補(bǔ)償。綜上所述，雙重檢測(cè)物鏡對(duì)于保證大樣本的高圖像質(zhì)量的重要性。
圖3 腸道和人類(lèi)結(jié)腸癌類(lèi)器官成像及單細(xì)胞分析
為了說(shuō)明新發(fā)布系統(tǒng)的高性能，作者對(duì)尺寸從200µm到550µm的多種樣品進(jìn)行了成像，并進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)12天的連續(xù)成像：小鼠肝類(lèi)器官，人類(lèi)結(jié)腸癌類(lèi)器官，小鼠腮腺唾液腺類(lèi)器官，和類(lèi)原腸胚。此外，新發(fā)布系統(tǒng)的樣品安裝策略不僅支持各種不同標(biāo)本的開(kāi)發(fā)，而且可以進(jìn)行平行化學(xué)擾動(dòng)的實(shí)驗(yàn)。在相同的成像實(shí)驗(yàn)中，四個(gè)腔室中的每一個(gè)都可以用于特定的條件，每個(gè)腔室內(nèi)有許多單獨(dú)的位置成像。我們分析了PGE、Forskolin和NaCl誘導(dǎo)的高滲休克對(duì)腸道類(lèi)器官的機(jī)械滲透作用。3分鐘的高時(shí)間分辨率(視頻3)顯示了對(duì)各自治療的快速類(lèi)器官膨脹和收縮。
平行的PGE、Forskolin和NaCl對(duì)腸道類(lèi)器官的影響
此外，為了證明新發(fā)布顯微鏡的多定位能力，作者以10分鐘的時(shí)間分辨率對(duì)25個(gè)成熟的腸道類(lèi)器官進(jìn)行了平行成像，每個(gè)類(lèi)器官的體積為360 µm(視頻4)。
總結(jié)： 本文作者提出并發(fā)布了一種雙側(cè)成像、 雙側(cè)照明的光片顯微鏡，適用于單細(xì)胞分辨率下對(duì)多種大型生物模型系統(tǒng)(如腸道類(lèi)器官等)進(jìn)行長(zhǎng)期多位置成像，質(zhì)量適合于整個(gè)類(lèi)器官的細(xì)胞分割和細(xì)胞跟蹤。特殊的物鏡配置使得使用多孔樣品池可以同時(shí)監(jiān)測(cè)多個(gè)實(shí)驗(yàn)條件。通過(guò)采用熱成型工藝制造各種形狀的樣品池實(shí)現(xiàn)了樣品特定和靈活的上樣。未來(lái)，具有這種物鏡配置和樣本池配置的光片顯微鏡將進(jìn)一步成為技術(shù)進(jìn)步的有前途的平臺(tái)。
參考文獻(xiàn)：
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[4] Serra et al., Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoids development. Nature
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更新時(shí)間：2023-11-02
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