從頭脂肪生成(DNL)是脂肪和肝臟組織產(chǎn)生脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵過程。該途徑的失調(diào)與肥胖、非酒精性脂肪性肝病和II型糖尿病密切相關(guān)。但是DNL在細(xì)胞內(nèi)的研究非常困難，常規(guī)的脂質(zhì)染料缺乏特異性，抗體和小分子染料很難特異性標(biāo)記這些脂質(zhì)體。雖然目前可以使用葡萄糖基代謝探針等同位素來標(biāo)記這些物質(zhì)，但是很難具備亞微米級(jí)別的空間分辨率，同時(shí)無法對細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行成像，也不能提供脂質(zhì)的特性和其他環(huán)境生物分子的組成信息。這些都極大的限制了脂質(zhì)體的相關(guān)研究，尤其是活細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的研究。

美國PSC公司研發(fā)的全新非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)——mIRage的出現(xiàn)為上述問題提供了新的解決方案。mIRage采用新型光學(xué)光熱誘導(dǎo)共振（O-PTIR）技術(shù)，不僅具備傳統(tǒng)FTIR的特性，可以對物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，還克服了傳統(tǒng)紅外空間分辨率不足，無法精細(xì)表征細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的問題，其分辨高達(dá)500 nm，可在亞微米尺度上實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的觀測，與光學(xué)顯微鏡基本相同，有助于理解亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。設(shè)備光熱膨脹技術(shù)能夠在不接觸樣品的情況下進(jìn)行檢測，大幅度簡化了樣品制備過程，全程對樣品無污染，并且沒有米氏散射問題，可在不平整的表面上取得良好的譜線。而其探測機(jī)制使得mIRage能夠很大限度上避免水的干擾，真正實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的探測。

近期，耶魯大學(xué)成功安裝了非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)——mIRage，并在活細(xì)胞脂肪代謝研究中取得了新的進(jìn)展！

在該研究中，Sydney O. Shuster等人使用非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)——mIRage觀測DNL在活細(xì)胞和固定脂肪細(xì)胞中的分布。作者認(rèn)為在DNL、葡萄糖或其他碳水化合物代謝形成游離脂肪酸(FFA) 和甘油三酯的途徑中，首先形成糖酵解丙酮酸，后被帶進(jìn)線粒體，通過TCA循環(huán)轉(zhuǎn)化為檸檬酸鹽。檸檬酸鹽再轉(zhuǎn)化為酰基輔酶a和丙二酰輔酶a用于脂肪酸合成并產(chǎn)生甘油三酯，然后儲(chǔ)存在脂滴中作為能量儲(chǔ)備。通過mIRage對固定的3T3-L1細(xì)胞的成像分析，作者通過脂肪代表性的酯羰基振動(dòng)1747cm^-1成功定位到細(xì)胞中的大部分脂質(zhì)、甘油三酯的分布，并通過1655和1541cm^-1處的酰胺-I和酰胺-II帶定位蛋白質(zhì)。

DNL的代謝途徑與固定細(xì)胞的明場與紅外脂質(zhì)體與蛋白的熱圖成像

為了跟蹤葡萄糖代謝和DNL，作者給細(xì)胞喂入¹³C葡萄糖來代替¹²C葡萄糖。因?yàn)樗姆肿诱駝?dòng)模式與所涉及的原子質(zhì)量增加導(dǎo)致紅外波數(shù)的紅移，通過檢測發(fā)現(xiàn)羰基的拉伸震動(dòng)紅移了44 cm^-1。有趣的是1239 cm^-1的波段本身不能明確地區(qū)分給C-O-C或PO₂ ，而未標(biāo)記細(xì)胞中的不對稱拉伸在¹³C標(biāo)記后時(shí)消失，這可能是紅移到相鄰的峰中導(dǎo)致的。這表明該峰值的主要來源是C-O-C 甘油三酯和/或膽固醇酯的不對稱拉伸震動(dòng)，并且磷脂不會(huì)顯著地干擾3T3-L1脂肪細(xì)胞中的信號(hào)。而蛋白信號(hào)在這一過程中沒有變化，表明蛋白質(zhì)不會(huì)隨著¹³C葡萄糖的供給而偏移。與之相對，CH₃和CH₂相關(guān)的1450cm^-1波段蛋白質(zhì)和脂類的變形和伸展震動(dòng)的出峰不變。這可能是由于形成的甘油三酯來自游離脂肪酸和甘油的酯化。雖然兩者都是 FFA和甘油由葡萄糖通過糖酵解產(chǎn)生，但它們以不同的速度產(chǎn)生和回收，影響著這些波段的移動(dòng)速率。

進(jìn)一步對加入¹³C葡萄糖24、48和72小時(shí)后的細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示平均單細(xì)胞¹³C/¹²C比率在測試期間(72小時(shí))持續(xù)增加，最終比率為0.54±0.14。其中大部分的¹³C轉(zhuǎn)化成甘油三酯，并且DNL在空間上也是異質(zhì)的。

對不同時(shí)間點(diǎn)固定的細(xì)胞進(jìn)行觀測和對比其中的DNL含量

在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，也取得了和固定細(xì)胞類似的結(jié)果，并且活細(xì)胞的光譜圖像比固定的更清晰，細(xì)胞和與蛋白質(zhì)酰胺-I信號(hào)重疊較少證明了這項(xiàng)技術(shù)甚至可以檢測到活細(xì)胞中甘油三酯到¹²C甘油三酯¹³C比率的微小差異。

活細(xì)胞的DNL含量觀測

綜上所述，非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)——mIRage在細(xì)胞成像中具有優(yōu)異的潛力，可以提供脂質(zhì)種類的信息，提供對低濃度物質(zhì)如游離脂肪酸的定位，并允許對每個(gè)樣品的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)光譜特征進(jìn)行全面位置光譜分析，并且能夠應(yīng)用長時(shí)間觀測。這項(xiàng)技術(shù)未來將可以用于繪制細(xì)胞系和細(xì)胞內(nèi)DNL的比率、疾病狀態(tài)，進(jìn)一步揭示DNL 導(dǎo)致代謝紊亂的原因。在評估針對調(diào)節(jié)DNL和治療疾病的藥物方面提供諸多幫助。

參考文獻(xiàn)：

Spatiotemporal Heterogeneity of De Novo Lipogenesis in Fixed and Living Single Cells. J. Phys. Chem. B 2023, 127, 2918?2926

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