單細(xì)胞力譜在生命科學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)研究中起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞的力學(xué)特性直接反映了細(xì)胞的生理狀態(tài)，高通量測(cè)量單細(xì)胞的力學(xué)特征在疾病的診斷和治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。然而傳統(tǒng)手段卻有著諸多局限^[1]，這主要原因是缺乏一種能夠簡(jiǎn)單、高效抓取細(xì)胞并進(jìn)行力學(xué)測(cè)定的手段^[2]。多功能單細(xì)胞顯微操作FluidFM技術(shù)的出現(xiàn)給單細(xì)胞力學(xué)的研究帶來了新的希望。該技術(shù)結(jié)合了原子力顯微成像技術(shù)與微流控技術(shù)，能夠通過中空的原子力探針將微球或細(xì)胞輕松進(jìn)行抓取，進(jìn)而通過細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)、微球與細(xì)胞等相互作用的方式，進(jìn)行nN到μN(yùn)級(jí)別的細(xì)胞水平的力的測(cè)量。

FluidFM技術(shù)源自瑞士ETH，一經(jīng)問世就*改變了單細(xì)胞水平科學(xué)研究的研究方式。目前，F(xiàn)luidFM技術(shù)主要有兩種解決方案，一是FluidFM OMNIUM一體機(jī)系統(tǒng)（單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)），可以自動(dòng)、高效的完成單個(gè)細(xì)胞的注射、提取、分離以及單細(xì)胞力譜測(cè)定。主要應(yīng)用于活細(xì)胞單細(xì)胞測(cè)序Live-Seq，活細(xì)胞線粒體移植，CRISPR-Cas9基因編輯，細(xì)胞系構(gòu)建等方面；另外一個(gè)方案是FluidFM ADD-ON系統(tǒng)（單細(xì)胞力譜檢測(cè)系統(tǒng)），它主要是用于單細(xì)胞力譜測(cè)定方面，具有操作簡(jiǎn)單、適用細(xì)胞種類多、通量高、力學(xué)范圍寬等優(yōu)勢(shì)。

FluidFM技術(shù)給研究者帶來了一種高效、低損的方式來抓取細(xì)胞的力學(xué)測(cè)定方案，能夠真正意義上的做到精準(zhǔn)、無損、快速的測(cè)量單細(xì)胞力譜，幫助研究者尋找細(xì)胞力學(xué)特征與細(xì)胞生長發(fā)育、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。本文將對(duì)使用FluidFM ADD-ON進(jìn)行單細(xì)胞力學(xué)研究的應(yīng)用案例進(jìn)行總結(jié)。

FluidFM ADD-ON單細(xì)胞力譜檢測(cè)系統(tǒng)

1. 真核細(xì)胞與不同類型基底之間的粘附特性研究

組織工程中仿生和響應(yīng)界面方面的研究開發(fā)是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。Cell-ECM相互作用可以直接調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附，遷移，生長，分化和凋亡，Sankaran等^[3]使用FluidFM技術(shù)研究了小鼠成肌細(xì)胞C2C12單細(xì)胞與共價(jià)表面、非共價(jià)表面整合素受體底物之間的相互作用情況（圖1a）。

用FluidFM探針抓取單個(gè)C2C12細(xì)胞后，控制細(xì)胞探針在基底(非共價(jià)表面和共價(jià)表面)上進(jìn)行Z軸方向的運(yùn)動(dòng)，并記錄圖2(a)中的力曲線。由力學(xué)曲線可以得出反映細(xì)胞與基底脫離的幾個(gè)具體參數(shù)，包括粘附力圖2(b)、剝離距離圖2(c)和總功2(d)，這些參數(shù)可以定量反映細(xì)胞與基底之間的粘附相互作用情況。

圖1 FluidFM技術(shù)的原理示意圖。圖中顯示細(xì)胞抓取前后的鏡下照片。

圖2 細(xì)胞與FluidFM懸臂梁接觸后即開始的代表性力-距離曲線。獲得粘附力、剝離距離、總功等數(shù)據(jù)。

本研究利用FluidFM技術(shù)簡(jiǎn)易、高效的完成了單細(xì)胞力譜的測(cè)定，結(jié)果表明，雖然與共價(jià)表面相比，生物活性配體在非共價(jià)表面上通過相對(duì)較弱的力結(jié)合在一起，但共價(jià)和非共價(jià)兩種表面的總細(xì)胞粘附力非常相近。進(jìn)一步探究其機(jī)理表明，粘附在共價(jià)和非共價(jià)表面的細(xì)胞之間的肌動(dòng)蛋白絲、局部粘附、粘附力和細(xì)胞收縮力等是相近的。

2. 真核細(xì)胞之間的粘附力測(cè)定

細(xì)胞在基質(zhì)上進(jìn)行單層培養(yǎng)時(shí)，吸附在基質(zhì)表面時(shí)主要有兩種不同類型的力，一種是細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附力，另一種是細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附力。因此對(duì)于細(xì)胞粘附力來說，單個(gè)細(xì)胞的粘附力就是細(xì)胞與基質(zhì)之間的作用力。而單層細(xì)胞的粘附力則是細(xì)胞之間相互作用力和細(xì)胞基質(zhì)與細(xì)胞之間作用力之和。因而細(xì)胞間的相互作用力則可以通過同時(shí)測(cè)量單層細(xì)胞的細(xì)胞粘附力和單個(gè)細(xì)胞的粘附力做差即可得到，如下公式所示：

Force cell-cell ≌ Force Monolayer – Force Indiv.cell

為了能夠測(cè)量粘附力Sancho等^[4]使用FluidFM 技術(shù)，將探針靠近細(xì)胞至探針與細(xì)胞接觸，之后開始對(duì)探針腔內(nèi)增加負(fù)壓從而牢固的吸住細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞被抓取后通過儀器位移臺(tái)的移動(dòng)抬高探針并記錄過程中的力學(xué)變化，如下圖所示：

圖3 FluidFM對(duì)單個(gè)細(xì)胞及細(xì)胞層粘附力測(cè)量的示意圖及細(xì)胞粘附力柱狀圖。

從圖中顯示出當(dāng)探針開始靠近細(xì)胞后，探針表面開始出現(xiàn)壓力變化，如（圖3b）中的藍(lán)色區(qū)域所示。當(dāng)出現(xiàn)這種變化后就停止下降探針并開始施加負(fù)壓。這時(shí)候由于腔內(nèi)負(fù)壓，探針和細(xì)胞之間的結(jié)合變得緊密，導(dǎo)致探針被細(xì)胞向下拉動(dòng)，從而產(chǎn)生了（圖3b）中白色區(qū)域的力學(xué)變化。隨后隨著探針上升，細(xì)胞給以探針的拉力隨之增高，并逐漸達(dá)到臨界，使得細(xì)胞脫離基質(zhì)。這一過程的峰值即為細(xì)胞粘附力。

通過FluidFM技術(shù)，作者發(fā)現(xiàn)，單層的L929成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出的細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附力可以忽略不計(jì)，而來自HUVEC的細(xì)胞在每個(gè)細(xì)胞中都發(fā)揮著強(qiáng)大的細(xì)胞間粘附力。

3. 楊氏模量Young’s Modulus

內(nèi)皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Endothelial-to-Mesenchymal Transition, EndMT)可以引起血管重塑，Sancho等^[4]使用一種基于MSX1 (Muscle Segment Homeobox 1)過表達(dá)的體外模型來誘導(dǎo)EndMT，并應(yīng)用FluidFM技術(shù)對(duì)EndMT早期單層細(xì)胞的力學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)定。

Sancho通過表觀楊氏模量作為細(xì)胞剛度的特征參數(shù)來描述細(xì)胞自身的生物力學(xué)特性。測(cè)量是通過在FluidFM探針頂端抓取一個(gè)微珠，并在細(xì)胞的核區(qū)域進(jìn)行小凹陷來完成的(圖4d,e)。選用探針的懸臂梁的彈簧常數(shù)為0.2 N/m，孔徑為4 μm。將直徑為10 μm的聚乙二醇包覆聚苯乙烯珠(Micromer #01-54-104, Micromod Partikeltechnologie GmbH, Germany)固定在懸臂的孔徑處，將密度為5 μg/mL的小珠添加到含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。通過施加700 mbar的吸壓抓取珠子，并校準(zhǔn)偏轉(zhuǎn)靈敏度。接下來，將探針移動(dòng)到裝有細(xì)胞的蓋玻片的培養(yǎng)皿 (圖4e)。從懸臂開始，在5 μm的距離上在單層細(xì)胞的細(xì)胞核上進(jìn)行壓痕。該方法通過儀器內(nèi)部的位移臺(tái)以500 nm/s的速度完成，直到達(dá)到2 nN的設(shè)定值，數(shù)據(jù)采集頻率為2000 Hz。每一個(gè)壓痕都有2s的停頓和5 μm的收縮距離。在實(shí)驗(yàn)過程中，在300 mbar的負(fù)壓下，微珠被保留在頂端。采用改進(jìn)的赫茲模型擬合球形壓頭的力(nN) -壓痕(nm)曲線與球形壓痕修正的赫茲模型(圖4f,g)擬合計(jì)算出表觀楊氏模量，其中F為力，E為楊氏模量，R為球形壓痕半徑，&壓痕，v為泊松比，本研究設(shè)置為0.5。公式如下：

圖4 FluidFM 技術(shù)楊氏模量檢測(cè)示意圖，MSX1過表達(dá)的樣本細(xì)胞剛度增加。

通過計(jì)算表觀楊氏模量(Young’s Modulus)，作者發(fā)現(xiàn)，MSX1過表達(dá)細(xì)胞的剛度明顯大于對(duì)照細(xì)胞(圖4h)，其值大約是對(duì)照細(xì)胞的兩倍(克隆1從760 Pa到1530 Pa，克隆2從1565 Pa到2523 Pa)。結(jié)果表明，在EndMT過程的早期，HUAECs的彈性特性已經(jīng)發(fā)生變化，導(dǎo)致剛度增加。這些變化與已知的細(xì)胞骨架重組相一致，該重組可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)伸長和定向運(yùn)動(dòng)。

4. 細(xì)胞彈性譜圖

單個(gè)活細(xì)胞的力學(xué)特性已被證明是細(xì)胞生理狀態(tài)的重要指標(biāo)。細(xì)胞體與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)邊界的肌動(dòng)蛋白皮層(AC, actin cortex)由質(zhì)膜和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組成，通過豐富的跨膜和適配器蛋白連接在一起。AC的結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)緊密交織在一起，進(jìn)而影響分子機(jī)械傳感器的功能。

基于FluidFM技術(shù)的研究數(shù)據(jù)提供了關(guān)于細(xì)胞力學(xué)特征的豐富信息。Lüchtefeld等^[5]在楊氏模量的基礎(chǔ)上提出了一個(gè)擴(kuò)展的分析方法，以進(jìn)一步明確解釋肌動(dòng)蛋白皮層的特性，即彈性譜（Elasticity Spectra），用來計(jì)算細(xì)胞的胞體表觀剛度與壓痕深度的函數(shù)關(guān)系。彈性譜方法在一組細(xì)胞骨架影響藥物處理的細(xì)胞上進(jìn)行了測(cè)試和驗(yàn)證，顯示了擴(kuò)展當(dāng)前細(xì)胞力學(xué)表征的潛力。

使用FluidFM進(jìn)行彈性譜測(cè)量的具體實(shí)驗(yàn)方案是：選用孔徑為2 μm、彈簧常數(shù)為0.3 N/m的FluidFM探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將探針的孔道中填充含有0.1 mg/ml藍(lán)色熒光染料AMCA(7-氨基-4-甲基Coumarin，Sigma-Aldrich, USA)的生理溶液，用于堵塞檢測(cè)。將直徑為3 ~ 4 μm的綠色熒光珠(Phosphorex Inc, USA)放置在融合細(xì)胞層旁，通過微探針施加800 mbar的負(fù)壓壓力將其抓取在探針頂端。壓痕以1 μm/s的接近速度和100 nN的力設(shè)定值在5 × 5點(diǎn)的網(wǎng)格上進(jìn)行，間距為25 μm。

圖5 半徑為R的球形探針在具有楊氏模量的柔性材料上進(jìn)行納米壓痕實(shí)驗(yàn)示意圖。并獲得127條細(xì)胞力-壓痕曲線的典型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集。

圖6 單細(xì)胞彈性譜實(shí)驗(yàn)方案示意圖。并獲得 315個(gè)細(xì)胞的力-壓痕曲線數(shù)據(jù)集。

基于FluidFM技術(shù)進(jìn)行的彈性譜ES的雙層模型為更高通量的篩選影響AC力學(xué)的藥物，評(píng)估環(huán)境或生理病理?xiàng)l件對(duì)AC動(dòng)力學(xué)的，以及研究細(xì)胞內(nèi)力對(duì)細(xì)胞力學(xué)敏感性的影響提供了一個(gè)有價(jià)值的工具。

5. 原核細(xì)胞間相互作用力

白色念珠菌在醫(yī)院的慢性疾病患者中經(jīng)常形成耐藥生物膜。細(xì)胞粘附和生物膜的形成涉及細(xì)胞表面Als (agglutinin-like sequence)蛋白家族。在機(jī)械應(yīng)力下，Als蛋白的淀粉樣簇可以激活細(xì)胞粘附。

Dehullu等人^[6]使用FluidFM技術(shù)對(duì)酵母菌Als蛋白的功能進(jìn)行了研究，具體實(shí)驗(yàn)方案是通過儀器系統(tǒng)的負(fù)壓將一個(gè)酵母細(xì)胞固定在FluidFM空心探針上，另一個(gè)酵母細(xì)胞被物理性地阻隔在多孔膜中(圖7，A)。用熒光染料染色對(duì)酵母細(xì)胞的活性和細(xì)胞的完整性進(jìn)行標(biāo)記(圖7,B)。然后，通過FluidFM來記錄力學(xué)曲線，測(cè)量不同條件下酵母細(xì)胞之間的相互作用情況，如在改變淀粉樣蛋白序列或降低細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)密度等。

圖7 使用FluidFM技術(shù)檢測(cè)酵母-酵母細(xì)胞之間的相互作用力。

利用FluidFM技術(shù)，可以很容易地通過施加負(fù)壓力將單個(gè)原核細(xì)胞固定在FluidFM中空探針上，進(jìn)而可以測(cè)量微生物之間的相互作用力。文章結(jié)果表明，Als5蛋白在粘附細(xì)胞上的同源性結(jié)合是真菌聚集的主要方式。由于在許多微生物黏附素中發(fā)現(xiàn)了潛在的淀粉樣蛋白形成序列，作者推測(cè)這種基于淀粉樣蛋白的同源性黏附的新機(jī)制可能廣泛存在，并可能成為治療生物膜相關(guān)感染的一個(gè)有意義的靶點(diǎn)。

6. 微球與固定細(xì)菌之間相互作用

Mittelviefhaus^[7]等通過FluidFM技術(shù)開發(fā)并應(yīng)用了一種通用而高通量的方法來量化不同細(xì)菌細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附情況。具體實(shí)驗(yàn)方案是：二氧化硅微球通過FluidFM探針的通道負(fù)壓方便可逆地固定。該微球用于探測(cè)與固定在多巴胺涂層玻璃上的細(xì)菌的相互作用。通過聚多巴胺涂層將目標(biāo)細(xì)菌固定在玻璃表面，以防止測(cè)量過程中細(xì)菌的位移(圖8a)。將微球與一個(gè)單獨(dú)的細(xì)菌接觸——這一過程在顯微鏡的光學(xué)成像系統(tǒng)下進(jìn)行。在達(dá)到10 nN后，接觸保持5 s，然后收回懸臂并記錄力學(xué)曲線 (圖8b)。

然后再次使用該微球來測(cè)量與另一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的粘附力；進(jìn)而，通過一個(gè)短的超壓脈沖將第一個(gè)微球放下，然后通過相同的探針可以很容易地抓取另一個(gè)新的微球而進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。這樣便實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌細(xì)胞的高通量力學(xué)測(cè)量。

圖8 FluidFM技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌與基質(zhì)之間的粘附力

研究結(jié)果證實(shí)了疏水性在細(xì)菌起初附著在其自然宿主葉片上的作用情況。細(xì)菌粘附是細(xì)菌表面定植和群落形成的第一步。本文使用FluidFM技術(shù)可以可逆地固定功能化微球作為表面模擬物，并探測(cè)單個(gè)細(xì)菌的粘附。作者對(duì)不同大小和形態(tài)的葉片分離物進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育多樣性的單細(xì)胞力譜分析。對(duì)28株細(xì)菌的粘附測(cè)定顯示，疏水相互作用的差異較大，約為3個(gè)數(shù)量級(jí)。細(xì)菌的粘附力可高達(dá)50 nN。不同分離株的疏水性與細(xì)菌在植物中的滯留量呈正相關(guān)，這可能為病原菌成功的葉片定殖和潛在的病害暴發(fā)提供依據(jù)。

綜上所述，細(xì)胞水平的力學(xué)研究常用的方法是利用包被的AFM探針，目前缺乏一種能夠在不改變細(xì)胞性質(zhì)的同時(shí)測(cè)量細(xì)胞整體粘附力的方案。FluidFM 技術(shù)的出現(xiàn)改變了這一狀況。高精密的中空微流控探針能夠在精準(zhǔn)感知壓力的同時(shí)通過內(nèi)壓而非蛋白結(jié)合的方式牢固地抓取細(xì)胞而不改變細(xì)胞性質(zhì)，為單細(xì)胞力譜的測(cè)定打開了全新的局面^[8]。

瑞士Cytosurge 推出的全新的FluidFM 技術(shù)給單細(xì)胞力譜研究帶來了全新的解決方案。這種技術(shù)結(jié)合了原子力顯微鏡探測(cè)技術(shù)與精密的微流體控制系統(tǒng)，直接使用中空的原子力探針將細(xì)胞通過負(fù)壓抓取在探針表面，而不需要激活細(xì)胞的任何通路信號(hào)，為粘附力等細(xì)胞層面的力學(xué)測(cè)量帶來了很大的優(yōu)勢(shì)。一方面，這種方法能夠提供遠(yuǎn)比蛋白結(jié)合牢固多的粘附力，將細(xì)胞牢固地固定在探針上面，因此能夠直接從基質(zhì)上分離。而另一方面，由于沒有生物處理，這種方法不會(huì)改變細(xì)胞表面的任何通路，從而能夠得到接近細(xì)胞原生的數(shù)據(jù)。

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[相關(guān)產(chǎn)品]

1、多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)- FluidFM OMNIUMhttps://www.chem17.com/st166724/product_30207534.html