技術(shù)文章
TECHNICAL ARTICLES在基因治療域,慢病毒載體(Lentivirus)是種復(fù)制較慢的逆轉(zhuǎn)錄病毒,由HIV-1改造而來,常作為基因治療的載體使用。
慢病毒載體的制備流程需要對病毒的物理滴度和感染滴度進行檢測。
1. 現(xiàn)有的檢測手段(如p24 ELISA)因·病毒中p24蛋白的含量不同、含有p24蛋白的雜質(zhì)(如外泌體)等因素的影響,無法精準(zhǔn)地表征病毒的物理滴度,且此類方法均無法對空載病毒(無p24蛋白)進行表征,這就給感染滴度的檢測帶來了誤差。
2. 在復(fù)雜的病毒工業(yè)化制備流程中,只測量末端純化產(chǎn)品的滴度,無法真實反映各個生產(chǎn)環(huán)節(jié)的生產(chǎn)效率,而對各個生產(chǎn)環(huán)節(jié)的樣品都進行純化表征會浪費大量人力物力。目前研究者亟需種無純化、快速、檢測下限低的病毒表征手段。
3. 目前的病毒表征手段,均無法將病毒的物理參數(shù)如粒徑(與載體聚合相關(guān))與蛋白質(zhì)組分析聯(lián)系起來。因此,這些技術(shù)無法分析病毒滴度受樣品聚集或病毒破裂與分解影響的情況,因此無法區(qū)分單分散制劑與聚集樣品。
對于上述問題,美國NanoView公司所開發(fā)的全自動病毒熒光檢測分析系統(tǒng)是款無需純化的、全自動的可對病毒進行表征分析的全新設(shè)備。該設(shè)備能夠提供全·方位的病毒表征信息,包括病毒粒徑、病毒表面和內(nèi)部病毒蛋白、病毒物理滴度、空載比檢測、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及假型定量表征等。操作簡單,結(jié)果可靠。
全自動病毒熒光檢測分析系統(tǒng)的基本原理是種基于異性免疫捕獲技術(shù),允許研究者直接分析定群體的病毒。通過配套的試劑盒,客戶次性能夠分析多達16個不同的樣本,大大節(jié)省了時間和經(jīng)濟成本。
和傳統(tǒng)的病毒表征手段相比,全自動病毒熒光檢測分析系統(tǒng)有如下勢:
無需純化
NanoView的LentiView™技術(shù)可以對慢病毒進行檢測,將蛋白質(zhì)組信息與物理病毒滴度結(jié)合起來,無需樣品純化。只需 35 µl 未純化或純化的樣品,檢測濃度低至106VP/ml。無需擔(dān)心純化帶來的誤差,更精確地測量樣品間的表征和表達信息的差異。
慢病毒示意圖
全·方位的病毒粒徑分析
全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)能夠?qū)?gt;20 nm的病毒進行全方面的表征,無論是粒徑分布、空載病毒與完整病毒的假型分析均可在次測試中得到。并且所用來測試的樣本無需進行純化,避免因純化帶來的樣本偏差。
病毒滴度
病毒物理滴度的·常用檢測方法是p24 ELISA。該方法測量p24衣殼蛋白的濃度并將其轉(zhuǎn)化為病毒物理滴度。樣品中溶解的p24、不同病毒p24含量的不同以及病毒聚集會影響檢測準(zhǔn)確性。此外, p24 ELISA無法檢測缺少衣殼(空載)的顆粒。LentiView™可對樣品中病毒進行高靈敏度的定量檢測,獲得滴度數(shù)據(jù),區(qū)分完整和空載病毒并識別樣品中雜質(zhì)如可能經(jīng)過純化帶有的外泌體等。
紅色熒光抗體標(biāo)記病毒的內(nèi)部p24衣殼蛋白,用藍色熒光抗體標(biāo)記VSV-G,同時表達p24和VSV-G的病毒顯示粉紅色,并由 NanoView用軟件計數(shù)。
完整/空載病毒顆粒的比例
NanoView的LentiView™技術(shù)可以簡單快速地分析出完整/空載病毒顆粒的比例,區(qū)分完整(成功轉(zhuǎn)導(dǎo))和空載病毒并識別樣品中雜質(zhì),而完整/空載病毒顆粒的比例是確定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的主要依據(jù)。
完整病毒是表達VSV-G和/或ETL,且表達衣殼蛋白p24的病毒顆粒,空載病毒是表達VSV-G和/或ETL,未表達衣殼蛋白p24的病毒顆粒
LentiView™芯片表面固定的抗VSV-G抗體捕獲病毒后,即可檢測表面和內(nèi)部蛋白標(biāo)記物。在LentiView™獲得熒光圖像中,綠色熒光點代表沒有衣殼的VSV-G+病毒顆粒,黃色熒光點代表含有衣殼的完整病毒顆粒。
病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率
我們使用LentiView™對三種不同的慢病毒樣品進行了表征,檢測病毒顆粒亞群,進而研究這些載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。三種不同的慢病毒樣品分別為野生型慢病毒 (VSV wt)、含高濃度質(zhì)粒的工程化靶向配體 (ETL-HC)、含低濃度質(zhì)粒的工程化靶向配體 (ETL-LC)。
三種慢病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率
轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與物理滴度的對比
根據(jù)病毒碎片粒徑和病毒粒徑的差別,對每種載體中的病毒和病毒碎片數(shù)量進行統(tǒng)計。50nm以上的病毒與50nm以下的病毒碎片的比例和載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率之間存在很強的相關(guān)性。
載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和病毒與病毒碎片比例的對比
*定制化
客戶通過ViroFlex技術(shù)使用連接蛋白連接任意定制化的捕獲抗體,并結(jié)合到ViroFlex芯片表面進而捕獲所需的病毒,在自己的實驗室里輕松進行高度定制化的檢測。
ViroFlex的芯片捕獲抗體排布示意圖
ViroFlex定制化檢測原理:
將連接蛋白與所需的定制抗體連接
再將連接抗體的連接蛋白與ViroFlex芯片表面的連接蛋白抗體連接
所需的定制抗體從而結(jié)合到了芯片上
將樣品在芯片上孵育,定制抗體即可異性捕獲病毒
每個芯片多可結(jié)合兩種定制化捕獲抗體
ViroFlex芯片的捕獲原理(左)與普通芯片的捕獲原理(右)示意圖
ExoViewTM參數(shù)信息:
顆粒大小分辨范圍:20nm
·低檢測濃度為106 VP/mL
所需樣本體積:35 μL
激發(fā)波長:410 nm,488 nm,555 nm,640 nm,750nm
可次檢測16個樣本,每個樣本可同時檢測6個不同亞型及4種生物標(biāo)記的熒光定位
捕獲抗體:個芯片多允許6種捕獲抗體(+陰性對照)
熒光通道:4個熒光通道
相關(guān)產(chǎn)品
1、全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)
https://www.chem17.com/product/detail/35508627.html
2、ExoView外泌體全面表征試劑盒
https://www.chem17.com/product/detail/36142894.html
Copyright © 2024QUANTUM量子科學(xué)儀器貿(mào)易(北京)有限公司 All Rights Reserved 備案號:京ICP備05075508號-3
技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng)
管理登錄 sitemap.xml