近幾十年來，在再生醫(yī)學域，生物制劑的應(yīng)用經(jīng)歷了飛速的發(fā)展。在生物制劑中，干細胞正逐漸成為重要的研究對象。研究表明，干細胞的治療作用可能通過旁分泌作用實現(xiàn)，外泌體作為細胞旁分泌的種生物活性物質(zhì)，成為近年來的研究熱點。

       單外泌體表型分析是將免疫學與光學成像結(jié)合的種新技術(shù)^[1]。該技術(shù)用免疫異性結(jié)合將定的外泌體進行捕獲分離，然后再對目標外泌體的尺寸、分布、表面標志物及內(nèi)容物（如攜帶的蛋白質(zhì)、RNA、DNA及細胞因子）進行定量分析，從而更加全面地反映外泌體的性。單個外泌體表型分析技術(shù)在短短兩年時間，備受廣大科研工作者的關(guān)注。本文收集了該技術(shù)在干細胞域的相關(guān)應(yīng)用，供您參考。

International   Journal of Molecular Sciences：含外泌體的干細胞提取物可促進組織再生

       間充質(zhì)干細胞（MSC）能夠分泌具有生物活性的分子如生長因子，細胞因子和外泌體，其中外泌體能夠調(diào)控其它細胞，在受損傷組織處產(chǎn)生再生性微環(huán)境，是MSC生理功能的載體。外泌體可作為無細胞的再生治療方法，相比于細胞治療具有更高的安全性，更低的免疫原性，不會誘發(fā)形成腫瘤，且尺寸較小，更容易遷移至靶點。Gupta等^[2]發(fā)現(xiàn)通過培養(yǎng)MSC獲得的含生長因子，細胞因子和外泌體的提取物能夠促進細胞增殖及誘導干細胞遷移以修復受損組織。聯(lián)系之前的研究成果，這些因子共同作用的結(jié)果可應(yīng)用于再生治療方法的開發(fā)。

       其中，研究人員使用納米粒子追蹤（NTA）法檢測了提取物中納米顆粒的濃度和外泌體的總濃度，并用ExoView同時檢測了提取物中含不同蛋白標記物的外泌體的濃度、尺寸。結(jié)果可知，ExoView直接獲得了不同種類外泌體的濃度（圖1B）以及詳細的尺寸分布，眾數(shù)與均值（圖1C&D）。通過ExoView法還發(fā)現(xiàn)提取物中并沒有含CD63的外泌體。

圖1 A，NTA法檢測的提取物中納米顆粒濃度與外泌體濃度；

B，ExoView檢測的CD81和CD9外泌體濃度；

C，ExoView檢測的CD81和CD9外泌體尺寸分布；

D，ExoView檢測的CD81和CD9外泌體尺寸眾數(shù)與均值。

Cancer Cell Int：外泌體與miRNA調(diào)節(jié)成神經(jīng)管細胞瘤的干細胞性

       腦瘤中的部分細胞具有干細胞性，能夠自我更新并分化為不同細胞系。其中，成神經(jīng)管細胞瘤的病人有25%經(jīng)過傳統(tǒng)療法后5年內(nèi)復發(fā)并轉(zhuǎn)移導致死亡，存活的病人也受到化療和放療的副作用和并發(fā)癥影響，因此需要種安全有效的治療方法。腫瘤細胞的外泌體含有miRNA，能夠調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、代謝、凋亡等生理過程并與抗藥性相關(guān)。有研究表明腫瘤干細胞的外泌體運載了腫瘤細胞有的miRNA，能夠產(chǎn)生有于腫瘤發(fā)展的微環(huán)境。Choi等^[3]研究了成神經(jīng)管細胞瘤的外泌體及運載的miRNA及其在腫瘤治療中的潛在作用。其中，miR-135b和miR-135a在腫瘤干細胞中高表達，抑制兩者會導致具有腫瘤抑制作用的Angiomotin?like 2（AMOTL2）表達上升，使腫瘤干細胞的干細胞性下降。

       其中，研究人員使用ExoView通過熒光成像檢測腫瘤細胞與腫瘤干細胞的外泌體標記物，在兩種細胞的外泌體上均檢測到了Alix和Syntenin兩種膜內(nèi)蛋白，并且可以確定兩種膜內(nèi)蛋白與CD63/CD9外泌體標記物共定位（圖2）。

圖2 Exoview檢測外泌體上的Alix（a）與Syntenin（b）蛋白

Cells：誘導性多能干細胞外泌體在急性腎損傷中的保護作用

       骨髓干細胞（MSC）具有治療急性腎損傷的作用，促進腎小管上皮細胞的增殖并抑制細胞凋亡，且MSC分泌的外泌體也有相似的作用。研究發(fā)現(xiàn)，誘導性多能干細胞（iPSC）具有抗炎、抗氧化和抗細胞凋亡，在其他腎損傷模型中起保護作用，且iPSC也可以分泌有心臟保護作用的外泌體。于是，Collino等^[4]研究了iPSC外泌體在急性腎損傷中的作用。結(jié)果表明，iPSC外泌體在腎損傷模型中表現(xiàn)出保護作用，主要體現(xiàn)于保護線粒體、降低氧化應(yīng)激與抗炎三個方面。

       其中，研究人員使用ExoView檢測了含有不同蛋白標記物的iPSC外泌體的尺寸并統(tǒng)計了所有外泌體的尺寸分布。其中，含有CD81/CD63/CD9的外泌體直徑主要分布于50-110nm，CD44外泌體直徑主要分布于55-85nm（圖3）。

圖3 iPSC外泌體的尺寸分布

Nanoscale：溫敏水凝膠包被干細胞外泌體對術(shù)后腸痿的治療作用

       干細胞外泌體用于治療，若采用全身給藥，往往會被單核巨噬細胞清除導致外泌體到達患處的數(shù)量降低，影響治療效果。Berger 等^[5]采用了種溫敏水凝膠(Pluronic F-127 (PF-127)，poly (N-isopropylacrylamide))包被干細胞外泌體，通過表皮穿刺給藥來確認外泌體對術(shù)后腸痿的治療作用。相對于含外泌體的生理鹽水的靜脈注射/穿刺給藥，水凝膠穿刺給藥的外泌體更容易到達并停留在患處，且治療效果更好。

       在凝膠包被前，研究人員使用Exoview檢測了的制備的外泌體表面的蛋白標記物，確認外泌體表面含有CD81和CD63，而含CD9外泌體較少（圖4A）；進步使用熒光成像可以確認外泌體不含Calnexin（外泌體的陰性標記），表示外泌體未被污染（圖4B）。

圖4 ExoView檢測外泌體蛋白標記物（A）與外泌體是否被污染（B）

       綜上所述，Exoview作為新代的外泌體表征系統(tǒng)，不僅能夠勝任傳統(tǒng)外泌體表征系統(tǒng)的工作完成對外泌體的尺寸和分布進行統(tǒng)計，并且能夠?qū)⑦@種統(tǒng)計細化提供不同亞型外泌體之間分布及其表型的區(qū)別。提供更為詳實的外泌體研究數(shù)據(jù)，幫助研究者更好的研究干細胞來源的外泌體在心血管系統(tǒng)、外傷性腦損傷、肌肉骨骼系統(tǒng)、腎損傷等方面的強大修復再生和保護能力，闡明其中的機理。為再生醫(yī)學治療的提供種全新的分析手段。

參考文獻：

[1] Scherr, S. M., Daaboul, G. G., Trueb, J., Sevenler, D.,   Fawcett, H., Goldberg, B., ... & U?nlu?, M. S. (2016). Real-time capture and visualization of   individual viruses in complex media. ACS nano, 10(2), 2827-2833.

[2] Gupta, A., Cady, C., Fauser, A. M., Rodriguez, H. C.,   Mistovich, R. J., Potty, A. G., & Maffulli, N. (2020). Cell-free Stem   Cell-Derived Extract Formulation for Regenerative Medicine Applications.   International Journal of Molecular Sciences, 21(24), 9364.

[3] Choi, S. A., Koh, E. J., Kim, R. N., Byun, J. W., Phi, J.   H., Yang, J., ... & Kim, S. K. (2020). Extracellular vesicle-associated   miR-135b and-135a regulate stemness in Group 4 medulloblastoma cells by   targeting angiomotin-like 2. Cancer cell international, 20(1), 1-14.

[4] Collino, F., Lopes, J. A., Tapparo, M., Tortelote, G. G.,   Kasai-Brunswick, T. H., Lopes, G., ... & Lindoso, R. S. (2020).   Extracellular vesicles derived from induced pluripotent stem cells promote   renoprotection in acute kidney injury model. Cells, 9(2), 453.

[5] Berger, A., Araújo-Filho, I., Piffoux, M., Nicolás-Boluda,   A., Grangier, A., Boucenna, I., ... & Silva, A. K. (2021). Local administration   of stem cell-derived extracellular vesicles in a thermoresponsive hydrogel   promotes a pro-healing effect in a rat model of colo-cutaneous post-surgical   fistula. Nanoscale, 13(1), 218-232.

全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)（ExoView R100）簡介

       Nanoview所開發(fā)的全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)（ExoView R100）是款無需純化的全自動的新型外泌體表征設(shè)備。該設(shè)備能夠提供外泌體表征信息，包括顆粒大小、計數(shù)、表型與生物標志物共定位等，提供多層次和全面的外泌體測量解決方案。ExoView R100允許研究者直接分析定群體的外泌體或外囊泡。通過ExoView芯片，客戶能夠直接多分析9個不同的樣本，節(jié)省成本、時間，并減少純化所帶來的偏差。為了更好的服務(wù)您的科研工作，Quantum   Design中國也建立了樣機演示實驗室，可以為您提供業(yè)的售前、銷售、售后技術(shù)支持，歡迎老師參觀試用！