在過(guò)去的十年里，紅外（IR）光譜已被廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物組織中的膠原蛋白研究。對(duì)有序膠原蛋白光譜的更好理解將有助于評(píng)估受損膠原蛋白和疤痕組織等疾病。因此，用偏振紅外光研究膠原蛋白（I型膠原和II型膠原）的層狀結(jié)構(gòu)和徑向?qū)ΨQ性逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前，基于焦平面陣列檢測(cè)器的偏振遠(yuǎn)場(chǎng)（FF）傅立葉變換紅外（FTIR）成像、偏振遠(yuǎn)場(chǎng)（FF）、光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）以及散射型掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡（s-SNOM）的納米紅外技術(shù)在膠原蛋白域得到廣泛應(yīng)用。偏振遠(yuǎn)場(chǎng)（FF）方法可應(yīng)用于完整肌腱的截面，其纖維平行且垂直于偏振光排列。光學(xué)光熱IR紅外（O-PTIR）和納米傅立葉變換紅外（nano-FTIR）方法則應(yīng)用于直徑為100~500 nm的原纖維，在生物聚合物上共同實(shí)現(xiàn)互相印證和互補(bǔ)的結(jié)果。

       通常，I型膠原蛋白在偏振紅外光下反應(yīng)不同。采用基于焦平面陣列（FPA）檢測(cè)的遠(yuǎn)場(chǎng)傅里葉變換IR（FF-FTIR）對(duì)其進(jìn)行成像時(shí)，受制于蛋白質(zhì)酰胺I和II的紅外征峰吸收帶的波長(zhǎng)（~7 μm）的分辨率限，難以獲取高質(zhì)量的成像結(jié)果。而采用散射型掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡（s-SNOM）方法的納米FTIR（nano-FTIR）光譜技術(shù)，可以獲得空間分辨率約為20nm的紅外光譜，解決了受限于IR輻射波長(zhǎng)的限制（通常5-10 μm）。此外，采用光學(xué)光熱紅外技術(shù)（O-PTIR）成像和光譜學(xué)的方法，也可以擺脫紅外波長(zhǎng)的限制，實(shí)現(xiàn)亞微米（500nm）的空間分辨率，為完整組織和原纖維膠原蛋白的研究打開(kāi)了個(gè)新窗口。

       近期，在Kathleen M. Gough等人的研究中^[1]，作者采用基于光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）技術(shù)的PSC非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng) mIRage對(duì)樣品?500 nm單點(diǎn)區(qū)域收集振動(dòng)光譜，如圖1所示。該光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）技術(shù)的工作原理是光熱檢測(cè)，其中紅外量子聯(lián)激光器（QCL）激發(fā)樣品在1800–800 cm^-1光譜范圍內(nèi)的分子振動(dòng)。產(chǎn)生的光熱效應(yīng)通過(guò)短波長(zhǎng)探測(cè)激光器檢測(cè)。圖2A-B中的光譜表明，固有的激光偏振所獲得的高對(duì)比度所產(chǎn)生的光譜與使用FTIR焦平面陣列和偏振器組合進(jìn)行的光譜測(cè)試近乎致。并且對(duì)于安裝在玻璃顯微鏡的不同載玻片，樣品均獲得了具有良好SNR的高質(zhì)量光譜。

圖1. 完整肌腱的光學(xué)光熱IR（O-PTIR）光譜，?500 nm測(cè)量點(diǎn)。（A）用線性偏振量子聯(lián)激光器（QCL）從CaF₂窗口在平行和垂直兩個(gè)不同方向上獲得光譜。插入的可視圖像顯示了6個(gè)采譜位置；比例尺= 70 µm。（B）對(duì)比從CaF₂（頂部）和玻璃（底部）載玻片在線性偏振QCL的平行和垂直方向上獲得的光譜。

       光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）技術(shù)可以通過(guò)在載物臺(tái)上輕易地旋轉(zhuǎn)樣品來(lái)測(cè)試平行和垂直于紅外激光偏振方向的光譜。并用光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）技術(shù)在幾個(gè)單頻率下對(duì)原纖維成像，以獲得表觀物理寬度的確定性估計(jì)。如圖2右側(cè)所示，在垂直方向上， 1655 cm^-1處記錄的單波長(zhǎng)圖像的紅黃帶表明該原纖維的寬度不超過(guò)500 nm。該尺寸將目標(biāo)物標(biāo)定為真正的原纖維，并且可與紅外s-SNOM實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的300 nm原纖維相當(dāng)。光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）技術(shù)與nano-FTIR的測(cè)試結(jié)果相互印證，反映了“原纖維”寬度的標(biāo)準(zhǔn)范圍。此外作者觀察到，來(lái)自原纖維的酰胺I和II譜帶比完整肌腱的窄，并且相對(duì)強(qiáng)度和譜帶形狀都發(fā)生了變化。這些光譜反映出在偏振紅外光下正常I型膠原纖維的更多有用信息，并可作為研究膠原組織的基準(zhǔn)。

圖2. 從CaF₂窗口用O-PTIR測(cè)試控制肌腱原纖維獲得的光譜。用平行于激光偏振的原纖維獲得的頂光譜（紅色）；藍(lán)色是垂直方向上的光譜。右側(cè)是在垂直方向基于1655 cm^-1的單波長(zhǎng)圖像。正方形表示光譜采集位置。比例尺= 1 µm。

       與基于焦平面陣列檢測(cè)器的偏振遠(yuǎn)場(chǎng)傅立葉變換紅外（FF-FTIR）光譜相比，光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）具有更高的空間分辨率，且可提供單波長(zhǎng)光譜。使用FF-FTIR FPA探測(cè)往往包括其他非膠原材料。同時(shí)，光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）還可以提供偏振平行于原纖維取向的原纖維光譜。這也是光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）和納米FTIR光譜對(duì)直徑為100~500 nm的膠原原纖維給出證實(shí)性和互補(bǔ)性結(jié)果的*證明。綜上所述，這些結(jié)果為進(jìn)步研究生物樣品中的膠原蛋白提供了廣闊的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]. Gorkem Bakir, Benoit E. Girouard,  Richard Wiens, Stefan Mastel, Eoghan Dillon, Mustafa Kansiz, Kathleen M. Gough, Molecules 2020, 25, 4295; doi:10.3390/molecules25184295.